Chapitre 5 — Les méthodes d’étude des protéines · Topic 1 : Isoler et séparer les protéines · Leçon 1.2
Les protéines sont extraites, mais elles sont encore mélangées par milliers. La chromatographie va les trier. Son idée générale : faire passer le mélange à travers une colonne, où chaque protéine avance à sa propre vitesse selon une propriété précise. Trois variantes répondent à trois propriétés : la charge, la taille, et l’affinité pour un ligand.
🎯 Objectifs pédagogiques
À la fin de cette leçon, tu sauras :
- décrire le principe général d’une chromatographie (phase fixe / phase mobile) ;
- expliquer la chromatographie par échange d’ions (charge) ;
- expliquer la filtration sur gel (taille) et son ordre d’élution ;
- expliquer la chromatographie d’affinité (ligand spécifique) ;
- comprendre pourquoi on les enchaîne pour purifier.
🧭 Plan de la leçon
- Le principe général
- Chromatographie par échange d’ions (charge)
- Chromatographie par filtration sur gel (taille)
- Chromatographie d’affinité (ligand)
1. Le principe général
La chromatographie sépare les protéines par leur migration différentielle à travers une colonne composée de deux phases :
- la phase fixe (solide) : des billes fonctionnalisées selon le type de chromatographie. Ce sont elles qui exploitent une différence de charge, de taille ou d’adsorption spécifique ;
- la phase mobile : un tampon d’élution qui transporte l’échantillon à travers la phase fixe.
À la sortie de la colonne, on recueille le tampon au goutte-à-goutte sous forme de fractions d’élution (les éluats), un tube par intervalle de temps. On dose ensuite les protéines de chaque fraction (par exemple par absorption UV des acides aminés aromatiques — Phe, Tyr, Trp).
Colonne = phase fixe (billes fonctionnalisées) + phase mobile (tampon d’élution). On collecte des fractions d’élution. Selon les billes, on sépare par charge, taille ou affinité.
2. Chromatographie par échange d’ions (charge)
Séparation selon la charge des protéines (portée par les chaînes latérales ionisables, donc fonction du pKa et du pH). Les billes sont chargées positivement ou négativement.
Principe : au pH du tampon, les protéines de charge opposée à celle des billes sont retenues (interactions ioniques) ; celles de même charge ne sont pas retenues et sortent en premier. On fait ensuite varier le pH du tampon : la charge de la protéine d’intérêt change, et elle se décroche des billes.
3. Chromatographie par filtration sur gel (taille)
Séparation selon la taille (poids moléculaire). Avantage majeur : c’est une méthode sans traitement dénaturant, qui renseigne donc sur la taille de la protéine native (fonctionnelle). Les billes sont poreuses (pores et canaux de diamètre donné).
Principe — attention, c’est contre-intuitif :
- les grosses protéines ne peuvent pas entrer dans les pores : elles contournent les billes (trajet court) et sortent en premier ;
- les petites protéines pénètrent dans les billes : trajet plus long, elles sortent en dernier.
En filtration sur gel, ce sont les grosses protéines qui sortent en premier (et non l’inverse) : trop grandes pour entrer dans les billes, elles prennent le chemin le plus court. Les petites, « piégées » dans les pores, font un détour et sortent en dernier. C’est le piège classique du concours.
4. Chromatographie d’affinité (ligand)
Séparation par adsorption spécifique. C’est une technique très puissante, mais qui exige un échantillon déjà assez pur. Les billes portent un ligand spécifique de la protéine d’intérêt, lié de façon covalente (un substrat, un inhibiteur spécifique…). Elle suppose donc d’avoir identifié un ligand qui interagit spécifiquement avec la protéine recherchée.
Principe : seule la protéine d’intérêt se fixe aux billes via son ligand (par des liaisons faibles) ; toutes les autres protéines sortent dès le début. On applique ensuite un tampon d’élution (par exemple un gradient de sel) qui rompt les liaisons faibles ligand-protéine : la protéine d’intérêt est libérée.
Le mot « chromatographie » vient du grec chroma (couleur) et graphein (écrire). Il a été forgé vers 1900 par le botaniste russe Mikhaïl Tsvet, qui sépara des pigments végétaux (chlorophylles, caroténoïdes) sur une colonne : les pigments formaient des bandes colorées le long du tube. Joli clin d’œil : « Tsvet » signifie justement « couleur » en russe.
En pratique, pour purifier l’enzyme pancréatique, on enchaîne les trois chromatographies (échange d’ions, puis filtration sur gel, puis affinité), en ne gardant à chaque étape que la fraction contenant l’activité enzymatique. À la fin, la protéine est isolée — et on vérifie sa pureté par électrophorèse (leçon 1.3).
Échange d’ions → charge (rétention des charges opposées, élution par variation de pH). Filtration sur gel → taille (grosses en premier, petites en dernier ; protéine native). Affinité → ligand spécifique (très puissante).
🧠 À retenir absolument
- Colonne = phase fixe (billes) + phase mobile (tampon d’élution) ; on collecte des fractions d’élution.
- Échange d’ions : sépare selon la charge ; billes chargées retiennent les charges opposées ; on élue par variation de pH.
- Filtration sur gel : sépare selon la taille ; grosses protéines en premier, petites en dernier ; mesure la taille native.
- Affinité : sépare par ligand spécifique (covalent sur les billes) ; très puissante ; élution par rupture des liaisons faibles (gradient de sel).
- On enchaîne les trois pour purifier, puis on vérifie la pureté par électrophorèse.
❓ Questions fréquentes
Quelles sont les deux phases d’une chromatographie ?
La phase fixe (solide), constituée de billes fonctionnalisées qui exploitent une propriété des protéines (charge, taille ou affinité), et la phase mobile, un tampon d’élution qui entraîne l’échantillon à travers la colonne. On recueille à la sortie des fractions d’élution.
Sur quoi repose la chromatographie par échange d’ions ?
Sur la charge des protéines. Les billes, chargées positivement ou négativement, retiennent les protéines de charge opposée (au pH du tampon) ; celles de même charge ne sont pas retenues et sortent en premier. On décroche ensuite la protéine d’intérêt en faisant varier le pH.
En filtration sur gel, quelles protéines sortent en premier ?
Les plus grosses. Trop grandes pour entrer dans les pores des billes, elles contournent ces dernières et prennent le chemin le plus court. Les petites protéines, qui pénètrent dans les billes, font un trajet plus long et sortent en dernier.
Pourquoi la filtration sur gel renseigne-t-elle sur la protéine native ?
Parce qu’elle ne fait intervenir aucun traitement dénaturant : la protéine garde sa conformation fonctionnelle pendant la séparation. La taille mesurée est donc celle de la protéine native, contrairement à la SDS-PAGE qui dénature les protéines.
Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité ?
Une séparation par adsorption spécifique : les billes portent un ligand spécifique de la protéine d’intérêt (substrat, inhibiteur…), lié de façon covalente. Seule la protéine recherchée se fixe ; les autres sortent au début. On la libère ensuite en rompant les liaisons faibles, par exemple avec un gradient de sel.
🚀 Pour aller plus loin
La protéine est purifiée ; reste à vérifier sa pureté et à analyser sa taille — c’est le rôle de l’électrophorèse.
Contenu pédagogique original — Réussir SVT. L’équipe Réussir SVT.