Chapitre 5 — Les méthodes d’étude des protéines · Topic 1 : Isoler et séparer les protéines · Leçon 1.1
Avant d’analyser une protéine, il faut d’abord la sortir de la cellule et la concentrer là où elle se trouve. C’est le travail de préparation de l’échantillon. On va suivre un exemple fil rouge tout au long du chapitre : la purification d’une enzyme pancréatique, synthétisée dans le réticulum endoplasmique rugueux (RER). Première étape : broyer, trier par densité, puis extraire les protéines.
🎯 Objectifs pédagogiques
À la fin de cette leçon, tu sauras :
- expliquer pourquoi il faut une mesure d’activité pour suivre une protéine ;
- définir l’homogénat cellulaire ;
- décrire la centrifugation différentielle et l’ordre de sédimentation ;
- expliquer l’extraction des protéines par relargage salin.
🧭 Plan de la leçon
- Le prérequis : mesurer l’activité de la protéine
- Broyer le tissu : l’homogénat cellulaire
- La centrifugation différentielle
- Extraire les protéines totales (relargage)
1. Le prérequis : mesurer l’activité de la protéine
Pour isoler une protéine, il faut pouvoir la suivre à chaque étape. Le prérequis est donc de disposer d’une méthode de mesure de son activité.
Pour une enzyme, on procède souvent par colorimétrie : on met l’enzyme en présence d’un substrat incolore qu’elle transforme en un produit coloré. La coloration de la solution signale la présence de l’enzyme active — un repère précieux pour savoir, à chaque étape, dans quelle fraction elle se trouve.
Sans test d’activité, impossible de suivre la protéine pendant sa purification. Pour une enzyme : substrat incolore → produit coloré.
2. Broyer le tissu : l’homogénat cellulaire
On commence par se procurer le matériel de départ : soit en broyant le tissu (ici, le pancréas → un broyat), soit en collectant les sécrétions.
Le broyage produit un homogénat cellulaire : un broyat dans lequel les cellules ont été lysées (membranes rompues), mais où les organites restent à peu près intacts. C’est précisément ce qui va permettre, à l’étape suivante, de récupérer un organite entier — le RER — et la protéine qu’il contient.
3. La centrifugation différentielle
La centrifugation différentielle consiste à isoler l’organite d’intérêt à partir de l’homogénat, par une série de centrifugations de durées et de vitesses croissantes, jusqu’à l’ultracentrifugation. Entre chaque centrifugation, on récupère le surnageant que l’on transfère dans un nouveau tube pour la centrifugation suivante.
Le principe est simple : plus la vitesse (donc la force centrifuge) augmente, plus on fait sédimenter des éléments de moins en moins denses.
L’ordre de sédimentation, du plus dense au moins dense :
| Vitesse (force centrifuge) | Éléments qui sédimentent |
|---|---|
| Basse (≈ 1 000 g) | Éléments très denses : cellules entières, noyaux, cytosquelette |
| Moyenne (≈ 20 000 g) | Densité intermédiaire : mitochondries, grosses vésicules (lysosomes, peroxysomes) |
| Ultracentrifugation (≈ 80 000–150 000 g) | Faible densité : microsomes, petites vésicules, RER (organite d’intérêt) |
| Très élevée / longue | Densité moindre encore : ribosomes, virus, grosses macromolécules ; le surnageant final ne contient plus que le cytosol |
Pour l’enzyme pancréatique, on s’arrête dès qu’on a obtenu le culot contenant le RER.
À chaque tour, l’élément qui sédimente se retrouve dans le culot (au fond du tube) ; ce qui reste en suspension est le surnageant (transféré pour la centrifugation suivante). On augmente progressivement la vitesse pour faire tomber des éléments de plus en plus légers — pas l’inverse.
L’ultracentrifugeuse a été inventée en 1925 par le Suédois Theodor Svedberg, qui reçut le prix Nobel de chimie en 1926. C’est avec elle qu’il détermina pour la première fois la masse de protéines comme l’hémoglobine. Son nom est resté : l’unité de sédimentation, le svedberg (S), sert encore à désigner les ribosomes (par exemple les sous-unités 40S et 60S).
4. Extraire les protéines totales (relargage)
Le culot contenant le RER renferme l’enzyme, mais aussi d’autres éléments à éliminer (notamment les membranes lipidiques). Il faut donc extraire les protéines de ce mélange.
L’extraction exploite l’insolubilité des protéines dans les solutions salines très concentrées — c’est le relargage. Le raisonnement :
- les sels sont des composés ioniques qui attirent fortement l’eau ;
- à forte concentration, le sel capte les molécules d’eau et en prive les protéines ;
- privées d’eau, les protéines s’agrègent entre elles, deviennent plus denses et sédimentent au fond du tube ;
- les lipides, de densité bien moindre, ne sédimentent pas et restent en suspension.
On sépare ainsi la partie protéique (au culot) de la partie lipidique (en suspension).
Centrifugation différentielle = tri par densité (vitesses croissantes ⇒ on fait tomber du plus dense au moins dense). Relargage = extraction des protéines par forte concentration en sel (les protéines, privées d’eau, s’agrègent et sédimentent ; les lipides restent en suspension).
🧠 À retenir absolument
- Suivre une protéine nécessite un test d’activité (enzyme : substrat incolore → produit coloré).
- Homogénat = broyat où les cellules sont lysées mais les organites intacts.
- Centrifugation différentielle : vitesses croissantes ⇒ sédimentation du plus dense au moins dense (1 000 g : noyaux/cytosquelette → 20 000 g : mitochondries, lysosomes, peroxysomes → 80 000-150 000 g : microsomes, RER → puis ribosomes ; surnageant final = cytosol).
- On récupère le culot d’intérêt ; le surnageant est transféré entre chaque centrifugation.
- Relargage : forte [sel] ⇒ protéines privées d’eau s’agrègent et sédimentent ; lipides en suspension.
❓ Questions fréquentes
Qu’est-ce qu’un homogénat cellulaire ?
C’est un broyat de tissu dans lequel les cellules ont été lysées (leurs membranes rompues) mais où les organites restent à peu près intacts. Cela permet ensuite de récupérer un organite entier, comme le RER, par centrifugation.
Comment fonctionne la centrifugation différentielle ?
On enchaîne des centrifugations de vitesses et de durées croissantes. À chaque tour, les éléments les plus denses sédiment au fond (le culot) ; on récupère le surnageant et on le centrifuge plus vite. En augmentant la vitesse, on fait progressivement sédimenter des éléments de moins en moins denses.
Dans quel ordre les constituants cellulaires sédimentent-ils ?
Du plus dense au moins dense : d’abord les cellules entières, noyaux et cytosquelette (≈ 1 000 g), puis les mitochondries, lysosomes et peroxysomes (≈ 20 000 g), puis les microsomes et le RER (ultracentrifugation, 80 000-150 000 g), enfin les ribosomes et grosses macromolécules. Le surnageant final ne contient plus que le cytosol.
Sur quoi repose l’extraction des protéines par relargage ?
Sur l’insolubilité des protéines dans une solution saline très concentrée. Le sel, qui attire fortement l’eau, prive les protéines de molécules d’eau : elles s’agrègent, deviennent plus denses et sédimentent. Les lipides, moins denses, restent en suspension, ce qui sépare protéines et lipides.
Pourquoi faut-il un test d’activité pour purifier une protéine ?
Parce qu’il faut pouvoir repérer la protéine à chaque étape de purification. Pour une enzyme, on utilise souvent une réaction colorée (substrat incolore transformé en produit coloré) : la fraction qui se colore est celle qui contient l’enzyme active.
🚀 Pour aller plus loin
L’échantillon est prêt ; il faut maintenant séparer la protéine d’intérêt des autres.
Contenu pédagogique original — Réussir SVT. L’équipe Réussir SVT.